不在有密码攻略
1、好的引物会让实验成功一半，引物设计一直都是非常重要的环节。然而，当实验室小白遇上引物设计，往往一片迷茫，不知所措……。今天，大师兄给大家总结了引物设计的10条黄金法则，可谓经典当中的经典，看到就是赚到。
2、文中还准备了科研福利——参与科研提问活动，小风扇、计时器免费领取哦，引物最好在模板的保守区内设计。序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。
3、引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度，常用的是18-27，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于聚合酶进行反应。引物含量在40%~60%之间，值最好接近72℃。
4、上下游引物的值是寡核苷酸的解链温度。有效启动温度，一般高于值5~10℃，其值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5、引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。引物3′端不能选择。
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1、当末位链为时，错配的引发效率大大降低，错配的引发效率介于、之间，所以3′端最好选择。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构，使引物本身复性。
2、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、3+等，引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。
3、扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。引物设计完成以后，应对其进行检测。
4、如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一，光是在引物设计这一步，就非常考验耐心和细节。
5、好在丁香实验早就给大家整理了好了关于的实验方法、步骤、经验等精华内容，还有问答广场，实时帮助大家解决遇到的实验问题，48小时内给出解决方案。「那么，问题来了」。